凝膠成像系統如何進行精確定量與分子量分析
點擊次數:71 更新時間:2025-10-09
凝膠成像系統通過光學成像與軟件分析結合,可實現分子量精確定量及濃度分析,其核心流程與技術要點如下:
一、分子量精確定量原理與步驟
標準曲線構建
系統利用已知分子量的DNAMarker條帶作為參照,通過軟件標注其位置并生成分子量-遷移距離的擬合曲線。該曲線基于電泳中分子量與遷移率的線性關系,確保未知條帶分子量計算的準確性。例如,DNA膠片上Marker條帶的分子量(如100bp、500bp、1000bp)被標注后,系統自動擬合曲線,用于后續未知條帶的分子量推算。
未知條帶分子量計算
將待測樣品電泳后的凝膠置于成像系統,通過紫外或可見光源激發熒光(如EB染色),軟件捕捉圖像后,根據未知條帶在凝膠中的遷移位置,結合標準曲線計算其分子量。此方法比肉眼估計更精確,誤差可控制在±5%以內。
二、濃度精確定量方法
密度標定與對比
系統先標定已知濃度的標準條帶(如DNA膠片上某條帶的DNA含量),再通過軟件點擊未知條帶,比較其與標準條帶的密度差異,計算未知樣品濃度。例如,若標準條帶密度為100單位,對應濃度為50ng/μL,未知條帶密度為50單位,則其濃度約為25ng/μL。
光密度線性關系
樣品對光的吸收量與濃度或質量呈線性關系。系統通過測量條帶的光密度(灰度值或熒光強度),結合標準曲線或已知樣品數據,推算未知樣品濃度。此方法適用于DNA、RNA及蛋白質凝膠(如PAGE膠)的濃度測定。
三、關鍵技術保障
光學系統優化
采用紫外透射光源或白光透射光源,確保光分布均勻,減少光密度不均對結果的影響。高分辨率CCD或數碼相機捕捉圖像,結合暗箱設計屏蔽外部光源干擾,提升成像質量。
軟件分析功能
軟件支持背景扣除、條帶分割、密度掃描等操作,可生成縱向掃描曲線圖并積分,實現精確定量。例如,PCR定量中,軟件可計算各條帶占總條帶的相對百分數,密度掃描則生成條帶灰度值的縱向分布曲線。
四、應用場景與優勢
分子生物學研究:精確測定DNA/RNA分子量及濃度,輔助基因克隆、測序驗證。
蛋白質工程:定量分析蛋白表達產物占比,優化發酵工藝。
藥物開發:通過濃度測定評估藥物純度,確保質量控制。
該系統通過標準化流程與先進技術,實現了分子量與濃度的雙重精確定量,為生命科學研究提供了可靠的數據支持。
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